酵母水解物中小肽的测定方法及意义

　　酵母中含有三类大分子：蛋白质、核酸和多糖，其中蛋白质几乎占了干物质一半以上的含量，必需氨基酸充足，呈味氨基酸丰富，总谷氨酸含量在6%以上，色氨酸在1%以上，所以酵母水解物诱食性绝佳。

　　新鲜酵母中的蛋白质经水解后产生的肽类物质，曾引起专家和配方师们的广泛关注与讨论，那么酵母水解物中的小肽具体含量应该是多少?是否可以精确、重复检测?以下内容是由湖北海宜为大家整理的小肽的定义及检测方法：

　　一、什么是小肽?

　　肽是蛋白质降解为游离氨基酸过程中的中间产物，通常将大于20个的氨基酸残基构成的肽称为多肽(Poly-peptide)，2-20个氨基酸残基构成的肽称为寡肽(Oligopeptide)，而将仅由2个或3个氨基酸残基构成的二肽和三肽称之为小肽(Small peptide)。(参考《动物营养学》第三版)

　　二、小肽含量的检测方法：

　　1、大豆肽粉，国标：GB/T 22492-2008

　　原理：采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分相对分子质量大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱法测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到大豆肽的相对分子质量大小及分布范围。

　　本法适用于以大豆粕或大豆蛋白等为原料，用酶解或微生物发酵法生产的，相对分子质量在5000以下，主要成分为肽的粉末状物质。

　　2、海洋鱼低聚肽粉，中国轻工行业标准：QB/T 2879-2007

　　2.1  低聚肽

　　方法原理：低分子量的蛋白质水解物(包含低聚肽及游离氨基酸)可溶于三氯乙酸溶液;高分子质量的蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质，收集离心清液。按照GB/T5009.5规定的方法测定离心清液的酸溶蛋白质水解物含量，清液的酸溶蛋白质水解物含量减去游离氨基酸含量即得到低聚肽的含量。

　　该法仅可以粗略测出样品中的三氯乙酸可溶性氮，并且不能扣除核酸中的含氮碱基对检测结果的干扰，更加不能精确检测二肽、三肽具体含量是多少。

　　2.2  相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物所占比例(高效凝胶过滤色谱法)

　　方法原理：相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物(包括低聚肽和少量游离氨基酸)所占比例，采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分子质量分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到蛋白质水解物的相对分子质量大小及分布范围，进而得到相对分子质量小于1000u的蛋白质水解物(包括低聚肽和少量游离氨基酸)所占比例。

　　本法适用于以海洋鱼皮、鱼骨或鱼肉为原料，用酶解法生产的，相对分子质量低于1000的低聚肽(短肽)为主要成分的粉末。

　　三、蛋白质的含量测定方法

　　蛋白质的含量测定是生化药品研究最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BCA法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法。《欧洲药典》6.0版、《英国药典》2009年版及《美国药典》32版附录中均收载了上述七种方法，《中国药典》2005年版三部附录仅收载了上述测定方法中的前三种。以下仅供参考：

　　3.1 凯氏定氮法：

　　原理：本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量。凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确测定。

　　3.2  福林酚法：

　　原理：本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与 Cu 2 + 螯合形成蛋白质- 铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

　　3.3  双缩脲法：

　　原理：本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与 Cu 2 + 形成紫红色络合物， 在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线， 采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

　　3.4  Bradford法(考马斯亮蓝法)：

　　原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

　　四、小结:

　　小肽 (二肽、三肽)作为蛋白质的主要消化产物，在氨基酸消化、吸收和代谢中起着重要作用。但酵母水解物与小麦水解蛋白、大豆肽粉等专属的肽类蛋白原料不同，它还含有核酸、多糖等其他大分子(约30%以上)。而且小肽的含量与酶解所用的酶制剂、添加比例、酶解时间、温度、pH值等均有一定的相关性，检测时在样品处理、国标、行业标准、实验室常用检测方法等方面，尚缺乏系统、精确、可重复性的检测方法方面的公开报道。而且，酵母水解物作为一种强诱食性的蛋白原料，只有以新鲜酵母为原料，经充分水解、干燥后才能呈现特有的鲜味，品控重点应以产品使用价值为目标，以《饲料原料目录》中强制标识要求为根据。

　　因此，我们暂时不建议将小肽作为酵母水解物的常规指标加以评估，而应该将方便饲料企业检测、且能反应出产品品质的指标，如粗蛋白、氨基酸态氮、核酸、甘露聚糖、水分、灰分等作为常规品控指标。

　　以上观点仅代表湖北海宜，不足之处还望同行及用户多多包涵，并欢迎共同探讨!